Film animasi ini menyajikan kisah kelam asal-usul musuh bebuyutan Batman, yaitu Joker. Diceritakan, seorang pria biasa yang bercita-cita menjadi komedian justru gagal total dalam kariernya. Demi menghidupi istrinya yang sedang hamil, ia nekat terlibat dalam rencana kriminal sebagai pemandu di pabrik kimia tempatnya bekerja.

Namun nasib buruk terus menghantamnya. Ia mendapat kabar bahwa istri dan calon anaknya meninggal dalam kecelakaan tragis. Meski sempat ingin mundur, ia tetap dipaksa menjalankan rencana tersebut. Saat aksi berlangsung, situasi berubah kacau hingga ia berhadapan dengan Batman dan akhirnya terjatuh ke dalam limbah kimia berbahaya.

Peristiwa itu mengubah fisiknya secara drastis, kulit memutih, rambut menjadi hijau, dan bibir memerah. Trauma kehilangan dan perubahan mengerikan ini membuatnya kehilangan kewarasan, menandai lahirnya Joker. Meski begitu, ia sendiri mengakui bahwa masa lalunya terasa kabur dan bisa berbeda-beda dalam ingatannya.

Di masa kini, Joker kembali berulah dengan cara yang jauh lebih sadis. Ia menembak Barbara Gordon hingga lumpuh dan menculik ayahnya, James Gordon. Di sebuah taman hiburan terbengkalai, Joker menyiksa Gordon secara psikologis, mencoba membuktikan bahwa satu hari buruk saja cukup untuk membuat siapa pun menjadi gila.

Namun, meski mengalami trauma berat, Gordon tetap bertahan secara mental dan meminta Batman untuk menangkap Joker sesuai hukum. Batman pun akhirnya menghadapi Joker dalam konfrontasi terakhir yang penuh ketegangan. Ia mencoba meyakinkan Joker untuk berhenti dan menerima bantuan, namun ditolak.

Film ditutup dengan momen ganjil sekaligus ikonik: Batman dan Joker tertawa bersama di tengah hujan, sebelum akhirnya Joker ditangkap, meninggalkan pertanyaan tentang batas kewarasan dan hubungan kompleks antara keduanya.