Kaley Christine Cuoco lahir pada tanggal 30 November 1985 di Camarillo, California. Ia adalah anak pertama dari pasangan Layne Ann (née Wingate), seorang ibu rumah tangga, dan Gary Carmine Cuoco, seorang agen real estate. Ayahnya berdarah Italia sedangkan ibunya memiliki keturunan Inggris dan Jerman. Kaley memiliki seorang adik perempuan bernama Briana, yang juga seorang aktris dan penyanyi.

Sejak kecil, Kaley merupakan seorang pemain tenis amatir yang berbakat. Ia mulai bermain tenis sejak usia tiga tahun. Namun, pada usia 16 tahun, ia memutuskan untuk meninggalkan olahraga tersebut dan beralih ke dunia akting.

Karir Kaley Cuoco dimulai pada tahun 1992 ketika ia tampil dalam film televisi thriller berjudul "Quicksand: No Escape". Pada tahun 1995, ia membuat debut filmnya sebagai Karin Carter dalam film aksi thriller "Virtuosity". Selanjutnya, ia muncul dalam beberapa film seperti "Toothless" (1997), "Can't Be Heaven" (1999), "Alley Cats Strike" (2000), dan "Growing Up Brady" (2000).

Pada tahun 2002, Kaley mendapatkan peran yang membuat namanya semakin dikenal, yaitu sebagai Bridget Hennessy dalam sitkom ABC berjudul "8 Simple Rules for Dating My Teenage Daughter". Selain itu, ia juga membintangi beberapa film dan serial televisi lainnya seperti "Crimes of Fashion" (2004), "Charmed" (2005-2006), dan "Brandy & Mr. Whiskers" (2004-2006).

Pada tahun 2007, Kaley mendapatkan peran yang menjadikannya terkenal di seluruh dunia, yaitu sebagai Penny dalam sitkom CBS berjudul "The Big Bang Theory". Ia memerankan seorang karyawan Cheesecake Factory yang bercita-cita menjadi aktris dan tinggal di seberang apartemen fisikawan Dr. Leonard Hofstadter dan Dr. Sheldon Cooper. Perannya dalam serial ini mendapatkan pujian dan penghargaan, termasuk Satellite Award, Critics' Choice Award, dan dua People's Choice Awards.

Setelah "The Big Bang Theory" berakhir pada tahun 2019, Kaley Cuoco terus aktif dalam dunia hiburan. Pada tahun 2020, ia membintangi dan menjadi produser eksekutif dalam seri komedi thriller "The Flight Attendant" di HBO Max. Serial ini mendapatkan pujian luas dari kritikus dan Kaley Cuoco mendapatkan nominasi di berbagai ajang penghargaan seperti Primetime Emmy Awards, Golden Globe Awards, Screen Actors Guild Awards, dan Critics' Choice Awards.

Selain karir aktingnya, Kaley Cuoco juga mendirikan perusahaan produksi bernama Yes, Norman Productions pada bulan Oktober 2017. Pada tahun 2014, ia menerima bintang di Hollywood Walk of Fame sebagai penghargaan atas kontribusinya dalam dunia hiburan.