Film keluarga musikal Alvin and the Chipmunks: The Squeakquel kembali menghadirkan petualangan seru Alvin, Simon, dan Theodore dengan tambahan rival baru yang tak kalah berbakat.

Cerita dimulai dua tahun setelah Chipmunks diadopsi oleh Dave Seville. Saat konser amal di Paris, Dave mengalami kecelakaan akibat ulah Alvin dan harus dirawat di rumah sakit. Ia pun meminta bibinya, Jackie, untuk menjaga Chipmunks. Namun, nasib berkata lain, Jackie juga mengalami kecelakaan, sehingga Alvin, Simon, dan Theodore akhirnya diasuh oleh Toby, sepupu Dave yang canggung tapi baik hati.

Sementara itu, mantan bos mereka, Ian Hawke, hidup terpuruk setelah kehilangan Chipmunks. Kesempatan bangkit datang saat ia bertemu trio tupai betina berbakat, Brittany, Jeanette, dan Eleanor yang kemudian dikenal sebagai Chipettes. Ian pun menjadikan mereka "senjata" baru untuk menghidupkan kembali kariernya, bahkan memfitnah Chipmunks agar para Chipettes menjauhi mereka.

Di sekolah baru, Chipmunks menghadapi perundungan, tapi juga mendapat kesempatan tampil di kompetisi musik untuk menggalang dana. Masalah muncul ketika Ian mendaftarkan Chipettes sebagai pesaing. Ketika kedua grup bertemu, muncul ketertarikan, tapi juga persaingan sengit akibat manipulasi Ian.

Konflik makin memanas saat Alvin terlena dengan popularitas dan melewatkan konser penting, membuat Chipmunks kalah. Hubungan mereka sempat retak, hingga akhirnya bersatu kembali setelah menyelamatkan Theodore dari bahaya.

Di sisi lain, Chipettes mulai menyadari sifat asli Ian yang manipulatif. Mereka dipaksa tampil di konser besar dan bahkan dikurung saat menolak. Dengan keberanian dan bantuan Chipmunks, mereka berhasil kabur tepat waktu.

Puncaknya, Chipmunks dan Chipettes tampil bersama di kompetisi sekolah, memukau penonton dan memenangkan hadiah untuk program musik. Dave yang telah pulih kembali dan akhirnya menerima Chipettes sebagai bagian dari keluarga mereka.