Film Marmaduke mengikuti kehidupan keluarga Phil Winslow (Pete Davidson sebagai pengisi suara Marmaduke) yang pindah ke Maryland bersama anjing Great Dane mereka bernama Marmaduke. Di pesta ulang tahun Billy (Brian Hull), Marmaduke membuat kekacauan saat melompat ke kolam renang dari lantai dua rumah. Aksi kocaknya direkam Barbara (Terri Douglas) dan videonya viral di internet.

Video itu menarik perhatian Guy Hilton (J.K. Simmons), pelatih anjing terkenal dunia yang menawarkan Marmaduke kesempatan menjadi anjing kompetisi profesional. Awalnya keluarga ragu, tetapi Phil (David Koechner) tergoda setelah mengetahui hadiah utama kompetisi mencapai USD 1 juta atau sekitar Rp16,7 miliar. Marmaduke pun mulai menjalani latihan keras dan perlahan berkembang menjadi anjing pertunjukan berbakat.

Masalah muncul saat Marmaduke mengikuti lomba lokal pertamanya. Ia dijebak anjing Afghan Hound bernama Zeus (Jason Anthony) hingga mengalami gangguan perut sebelum tampil. Di tengah kompetisi, Marmaduke malah kentut besar di arena dan membuat situasi kacau total. Guy merasa malu dan menolak melatihnya lagi, membuat Marmaduke kabur dari rumah.

Dalam perjalanannya, Marmaduke menyelamatkan kucing keluarga mereka, Carlos (Terri Douglas), lalu berkeliling dunia sambil melakukan berbagai aksi heroik. Pengalaman itu membuat Marmaduke semakin percaya diri hingga Guy mau melatihnya kembali untuk ajang World Dog Championship. Di kompetisi dunia itu, Marmaduke harus menghadapi Zeus dan berbagai anjing unik lainnya.

Pada tantangan terakhir, Marmaduke tampil memukau bersama Billy dan Carlos dengan aksi bertema koboi. Meski Zeus sempat diumumkan sebagai pemenang, Marmaduke berhasil membongkar kecurangan pemilik Zeus. Saat kekacauan terjadi, Marmaduke bahkan mempertaruhkan nyawanya demi menyelamatkan seorang kameramen. Untungnya ia selamat, menjadi juara sejati, dan kembali hidup bahagia bersama keluarganya.